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RNA的制備
新竹博美生物科技有限責任公司 / 2015-01-27

                                                                                                                                                    RNA的制備

1、 mRNA的分別   與rRNA和tRNA分歧的是,哺乳植物細胞的絕大部門mRNA在其3’端均有一poly(A)尾,是以可以用oligo(dT)-纖維素親和層析法從大批的細胞RNA平分離mRNA。在構建cDNA文庫時, 必需經上述純化步調制備mRNA模板。停止Northern雜交或Sl 核酸酶感化圖剖析時,與總RNA比擬,采取poly(A)+ RNA能取得更加滿足的成果。 可以依照Gilham(1964)所述辦法制備Oligo(dT)-纖維素,也能夠買現成的産品。 1)用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纖維素。 2)將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經用DEPC處置並經高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床體積爲0.5-1.0ml,用3倍柱床體積滅菌水沖刷柱床。柱床體積爲1m的oligo(dT)-纖維素最大批爲10mg總RNA,假如總RNA的量較少,則應削減oligo(dT)-纖維素的應用量以避免poly(A)+RNA在過柱和後續步調中喪失。 3)用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖刷柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液 20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.5mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.1%SDS 可按以下辦法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液;將過量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA儲存液混雜在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌,待其順序卻至65℃閣下時參加已在65℃預熱30分鍾的10 %SDS儲存液。也能夠用0.05mol/L檸檬酸鈉取代Tris.Cl 然後用DEPC處置檸檬鈉-NaCL-EDTA和SDS的混雜溶液。 4)用滅菌水消融RNA,于65℃溫育5分鍾後使敏捷冷卻至室溫,加等體積的2x層析柱加樣緩沖液,上樣,立刻用滅菌的試管搜集洗液。 當所的RNA溶液均進入柱床後,加1倍體積的1x層析柱加樣 ,持續搜集洗出液。加熱RNA可以損壞能夠觸及poly(A)尾的二級構造。 5)當全體溶液流出後,將搜集液置于65℃溫育5分鍾,從新上樣,並搜集流出液。 6)用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱,分部搜集洗出液,測定每搜集管的OD260。最補因為不帶poly)A)的RNA洗過柱床, OD260會很高,後來OD260值則很小或爲零。在某些計劃中,上述步調後還用5倍柱術體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床,但是因為洗出的不帶poly(A)的RNA很少乃至沒有, 是以這一步調可以省略。 7)用2-3倍柱床體積的經滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA,以1/3-1/2柱床體積分部搜集洗脫液。洗脫緩沖液 10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.05%SDS用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA儲存液應爲早先高壓的溶液 可用過量的滅菌水濃縮上述儲存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不克不及高壓處置,因高壓會使溶發生大批氣泡。 8)搜集液置于通明的小溶器內,測定OD260, 應用前比色杯須用濃鹽酸:甲醇(1:1)浸泡1小時,再用經DEPC處置並高壓處置過的水完全沖刷歸並含有RNA的洗脫組分。經上述一輪oligo(dT)-纖維素親和量層析後獲得的RNA中,帶與不帶poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA,可將洗脫液于65 ℃溫育3分鍾,敏捷冷卻至室溫,參加NaCl至終濃度爲0.5mol/L,用統壹oligo(dT)纖維素柱停止第二輪層析。 9)搜集oligo(dT)-纖維素柱層析的洗脫液,在mRNA溶液中參加3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終深度爲0.3mol/L並混勻。加2.5 倍體積用冰預冷的乙醇,混勻,冰浴至多30分鍾。 10)于4℃以10 000g離心15分鍾收受接管poly(A)+RNA,當心棄去上清液,用70 %乙醇洗濯沉澱(平日看不見沉澱),離心少焉,在空氣中晾幹核酸沉澱。 11)用大批水重溶RNA,置于比色杯內,測定OD260, 應用前比色杯須用濃鹽酸:甲醇(1:1)浸泡1小時,再用經DEPC處置並高壓處置過的水完全沖刷 12)將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內,加3倍體積乙醇, 混勻,于-70℃保留備用。收受接管RNA時,只需掏出一小份儲存液,加3mol/K乙酸鈉(pH5.2)至終濃度爲0.3mol/L, 混勻,用微量離心計心情于4℃以12 000g離心5分鍾便可。   注、1.OD260=1的溶液其RNA含量約爲40μg/ml。 2.從107個哺乳植物造就細胞中可取得1-5μg mRNA,所得mRNA平日只占上柱的總RNA的1-2%。 3.現可直接從公司購置純化試劑盒。  2、RNA酶活性的掌握   爲了取得高質量的真核細胞mRNA, 必需應用RNA酶的克制劑或采取下述的破裂細胞和滅活RNA酶同步停止的辦法,最大限制地下降細胞破裂過程當中所釋放的RNA酶的活性。同時,防止有時引入試驗室內其他潛伏的痕量RNA酶也很主要。上面羅列防止RNA酶法染成績的一些留意事項。大多半有經歷的研討者其實不拘泥于這些留意事項,只是在碰到成績時能夠采取個中的一種或幾種辦法加以處理。   (一)試驗法式   如不謹嚴操作,外源性RNA酶可以經由過程下述門路凈化RNA成品: (1)玻璃成品、塑料成品和電泳槽 滅菌的一次性應用的塑料成品根本上無RNA〈, /SPAN〉酶,可以不經預處置直接用于制備和儲存RNA。試驗室用的通俗玻璃器皿和塑料成品常常有RNA酶法染,應用前必需于180℃幹烤8小時或更長時光(玻璃器皿)或用氯仿沖刷(塑料成品)。另外壹種辦法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其他用品。DEPC是RNA酶的激烈克制劑,但其感化並非相對的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小時,然後用滅菌水淋洗數次, 並于100℃幹烤15分鍾。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鍾。上述處置可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC經由過程羧甲基化感化對RNA的嘌呤堿基停止潤飾。羧甲基化的RNA在無細胞系統中翻譯效力很低,但是,除非個中大部門嘌呤堿基均被潤飾,不然其構成DNA:RNA或RNA:RNA雜交休的才能其實不顯著下降。用于RNA電泳的電泳槽運用去汙劑洗清潔,再用水沖刷,用乙醇枯燥,然後灌滿3%的H2O2溶液,于室溫放置10分鍾,然後用0.1 %DEPC處置過的水完全沖刷電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料成品和電泳槽作上特別標誌,寄存在指定所在,爲RNA試驗公用。 (2)研討人員釀成的凈化 RNA酶最重要的潛伏凈化源是研討人員的手。是以,在預備分別的和剖析RNA的資料和溶液時,主有觸及RNA的一切操作過程當中,都應戴一次性手套,接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品今後,手套便可能感染上RNA酶,是以停止RNA試驗時應勤換手套。 (3)凈化的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研討公用的化學試劑配制溶液,用幹烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。能夠的話溶液均運用0.1%DEPC于37℃至多處置12小時,然後于100℃加熱15分鍾或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鍾。注:DEPC可與胺類敏捷產生化學反響,因些不克不及用來處置含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未新莊的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。  (二)RNA酶的克制劑 上面引見3種普遍運用的特異性RNA酶克制劑。 (1)RNA酶的卵白質克制劑是 從人胎盤分別的一種卵白質可與多種RNA酶慎密聯合(KI≈3x1010)構成非共價聯合的等摩爾複合物,使RNA酶掉活。此卵白質體內多是血管生成素的克制劑,血管生成素是氨基酸序列和推想的三級構造與胰RNA酶相似的一種血管生成因子, 幾個廠家以分歧的商品名出售這類克制劑,該卵白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的50%甘油中,儲存于-20℃。克制劑成品凍融數次後或放置在氧化前提下即應棄之不消,由於上述處置會使卵白量變性從而釋放出所聯合的RNA酶。是以,在應用變性劑裂解哺乳植物細胞這一提取RNA的初始步聚中不該應用這類卵白克制劑。但是職用更平和的裂解辦法時應應用這類克制劑,而且在後續的壹切RNA純化步調中均應有此卵白質存在。因為酚抽提可以除卵白質克制劑,故應在純化過程當中補加幾回克制劑。其最大活性的施展請求巯基試劑,並且它其實不攪擾反轉錄或mRNA在無細胞系統中的翻譯。 (2)氧釩核糖核苷複合物 這類由氧釩(1V)離子和4種核糖核苷當中的隨意率性一種所構成的複合物,是量種過渡態相似物,它能與多種RNA酶聯合並幾科能百分之百地克制RNA酶的活性。這4種氧釩核糖核苷複合物可參加完全細胞中,在RNA提取和純化的壹切過程當中,其應用濃度都是10mmol/L。所獲得的mRNA可直接在硅卵母細胞中停止翻譯, 並能作爲某些外酶促反響(如mRNA反轉錄)的模板。但是氧釩核糖核苷複合物激烈克制mRNA在無細胞系統中的翻譯,是以必需用含0.1%羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)均衡]屢次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷複合物。 (3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱黏土,許多年前就發明它能吸附RNA酶,用緩沖液將其制成漿液,以0.015%(W/V)的終濃度消融細胞。 這類黏土伴隨它所吸附的RNA酶可在後續的RNA純化過程當中(如酚抽提後)經離心去除。 (三)破裂細胞和滅活RNA酶同步停止的辦法   用激烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能敏捷消融卵白質, 招致細胞構造破裂,核卵白因為其二級構造的損壞而從核酸上解離上去。RNA酶可耐受多種處置等,是以可聯用上述試劑,從組織中,如富含RNA酶的胰腺中,提取完全無損的RNA。下述試驗法式系列應用RNA酶克制劑和(或)能敏捷滅活RNA酶的有關辦法從組織或細胞造就物平分離總RNA、核內RNA和胞質內RNA。這一從造就的單層哺乳植物細胞平分離RNA的試驗法式系爲Favaloro 等(1980)所引見法式的改進。該法式異樣實用于從懸浮造就的哺乳植物細胞中或從易于疏散成單個細胞的哺乳植物組織平分離RNA。但不實用于從固體組織中提取RNA,由於用這類裂解細胞的辦法(在SDS存在的前提下用卵白酶K消化)去消化組織速度很慢,招致內源性RNA酶在被卵白酶K消化或被克制劑滅活前有時光施展感化。原計劃中(Favaloro等。1980)采取的裂解緩沖液含有0.015 %(W/V)的Macaloid(硅藻土),用于吸附並滅活RNA酶。雖然現仍有Macaloid出售NL Chemicals), 但氧釩核糖核苷複合物和RNA酶的卵白質克制劑更經常使用。下述法式的長處是速度快,並能同時處置許多樣品。   A、細胞裂解  a.單層細胞的裂解 a)吸出造就液,以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖刷細胞造就皿內的單層細胞,反復1次,將平板置于冰上直至壹切單層細胞沖刷終了。也可將平板放在一塊鋁板上,再將鋁板置于冰盤上。 b)直徑爲90mm的造就皿需加0.5ml RNA提取緩沖液, 並使之遍及全部平板的外面。 RNA提取緩沖注液 0.14mol/L NaCl 1.5mmol/L MgCl2 10mmol/L Tris.Cl(pH8.6) 0.5%NP-40 1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT) 100單元/ml胎盤RNA酶克制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷複合物 c)加0.5ml卵白酶消化緩沖液,用刮棒混勻稀薄狀裂解物並將其刮到平板的邊沿。 卵白酶消化緩沖液 0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 0.3mol/L NaCl 2% SDS d)用裝有21號針頭的皮下打針器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。反復3-4次,剪切DNA。 c)加卵白酶K至終濃度爲200μg/ml,充足混勻後置于37℃溫育30分鍾。 卵白酶K以儲存液的情勢保留,儲存液爲20mg/ml 卵白K溶液。 b.懸浮造就的細胞或組織單細胞懸液的裂解 a)于4℃以2000g離心5分鍾搜集細胞,以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉澱,洗濯細胞3次,每次均用大口徑的吸管悄悄奏樂細胞沉澱,使其完全疏散。 b)估量細胞沉澱的體積,用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。 c)參加與步調b)所加RNA提取緩沖液體雷同的卵白酶消化緩沖液,用振蕩器敏捷混勻。用裝有21號針頭的皮下打針器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。反復3-4次,剪切DNA。 d)加卵白酶K至終濃度爲200μg/ml,充足混勻後置于37℃溫育30分鍾。卵白酶K以儲存的情勢保留,儲存液爲20μg/ml卵白酶K水溶液。B、提取步調 1)用等體積酚:氯仿抽提1次,以去除卵白質。 2)用吊桶式回頭于室溫以5000g離心10分鍾使水相與無機相分相, 將水相吸至一個新的離心管內,加2.5倍體積用冰預順序的乙醇,充足混勻, 于0℃放置1小時。 3)于0℃以5000g離心10分鍾沉澱RNA,棄上清,用含0.1mol/L 乙酸鈉(pH5.2)的70%乙酸洗濯沉澱,用主動微量移液器盡量將乙醇吸盡, 隨後于室溫放置幾分鍾,晾幹沉澱。切勿抽幹沉澱,由於幹的核酸沉澱很難消融。 4)每壹個直徑爲90mm的造就皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉澱。 5)分離按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇(DTT),然後分離按1000單元/或10mmol/L 的終深度加台盤RNA酶克制劑或氧釩核苷複合物。 6)參加無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度爲2μg/ml,混勻,于37℃溫育60分鍾。 7)分離按10mmol/L和0.2%的終濃度加EDTA和SDS。 8)用等體積酚:氯仿抽提1次。 9)于室溫以5000g離心10分鍾使水相與無機相分相, 將水相吸至另外壹個離心管內,加3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終濃度爲0.3mol/L,加2.5倍體積用冰預次的乙醇,充足混勻,冰浴放置2小時。 10)用微量離心計心情于4℃以12 000g離心5分鍾沉澱RNA。 11)吸出壹切的乙醇,將翻開管蓋的離心管在試驗台放置幾分鍾,讓最初殘余的痕量乙醇揮發清潔。 12)用200μl TE(pH7.6)重溶沉澱,加500μl乙醇,于-70 ℃儲存備用。收受接管DNA時,只須掏出1小份儲存液,參加3mol/L乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度爲0.3mol/L,充足混勻,用微量離心計心情于4℃以12 000g離心5分鍾便可。 C、留意事項 1.測定終究所得溶液的OD260值可以肯定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混雜液離心沉澱RNA,以400水重溶, 測定OD260 值, OD260=1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。 2.假如須要,可用oligo(dT) -纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸凈化的mRNA或購置試劑盒停止mRNA的純化。 3.某些情形下(例如從沾染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時),必需從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。不然,當用這類RNA構建cDNA庫或停止引物延長反響時應會出成績, 反轉錄過程當中法染的模板DNA片斷能夠會與RNA雜交而充任引物,從而招致物定mRNA5’末尾定位的毛病或發生截短的cDNA克隆。 a)步調12後,加200μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),用主動微量移液器重復吹吸,以重懸核酸沉澱,將懸浮液移至另外壹個滅菌的微量離心管內。 b)用微量離心計心情于室溫以12 000g離心10分鍾,RNA沉于管底,而絕大部門寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。 c)棄上清液,用200μl TE(pH7.6)重溶沉澱。參加20μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),分混勻,參加550μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液, 在冰上驟冷30分鍾。用微量離心計心情于4℃以12 000g離主10分鍾,以收受接管RNA。當心吸出上清。d)棄上清液,用300μl TE(pH7.6)重溶沉澱,加1ml乙醇,-70℃儲存備用。 收受接管RNA時,只需掏出1小份儲存液,加3mol乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度爲0.3mol/L充足混勻,用微量離心計心情于4℃以12 000g離心5分鍾便可。如需去除氧釩核糖核苷複合物,用含0.1%羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)均衡]將RNA終溶液抽提數次便可。 4. 對大多半細胞株來講, 一個直徑90mm 造就甲中造就的RNA收率爲100-200μg。用異硫氰酸胍和無機溶劑提取RNA   搜集細胞,離心5000r/min ,5分鍾,棄上清,參加異硫氰酸胍變性液(異硫氰酸胍4mol/L;檸檬酸鈉25mmol/L,Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol/L)500ml,混勻,振蕩10秒,加2 mol/L醋酸鈉50ml,水飽和酚500m l和氯仿/異戊醇(49:1)100m l倒置混雜數秒鍾,冰浴15分鍾,4℃離心10,000 r/min,15分鍾,汲取上清,參加等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇,, 4℃離心10,000 r/min,10分鍾,棄上清,70%酒精洗濯一次,抽幹,加35mlDEPC處置水消融,取5ml經濃縮後紫外測定RNA提取量,其他30ml分裝,-20℃保留備用。

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